BACULOVIRUS MODIFIE, SON PROCEDE D'OBTENTION, ET VECTEURS D'EXPRESSION OBTENUS A PARTIR DUDIT BACULOVIRUS

La présente Invention est relative à des vecteurs d'expression obtenus à partir de baculovirus modifiés, dans lesquels l'un des deux promoteurs tardifs forts du baculovirus sauvage est inactif.

Les baculovirus sont actuellement utilisés dans de très nombreux laboratoires comme vecteurs d'expression de gènes. En effet, ces virus possèdent les avantages suivants : ils permettent l'insertion de longs segments d'ADN et possèdent en outre deux promoteurs tar¬ difs forts, le promoteur de la polyédrine, et le promo¬ teur de la protéine P10, qui sont capables d'induire un niveau d'expression extrêmement élevé des gènes placés sous leur contrôle.

La publication de L.K. MILLER [CHAPITRE 14 "A

VIRUS VECTOR FOR GENETIC ENGINEERING IN INVERTEBRATES" du

Manuel "GENETIC ENGINEERING IN THE PLANTS SCIENCES"

(1981) N.J. PANAPOULOS, éd., Praeger Pub. New York, p. 203-224] décrit les avantages de l'utilisation des bacu¬ lovirus, et en particulier du baculovirus Autographa californica (AcNPV) , comme vecteurs d'expression de gènes étrangers dans des cellules-hôtes d'insectes. Le baculo¬ virus AcNPV décrit dans cette publication possède deux formes matures respectivement appelées forme non occlu¬ sive (NOV) et forme occlusive (OV) . Les formes non occlu¬ sives sont responsables de la transmission du virus en culture cellulaire ou à l'intérieur d'un même organisme. Les formes occlusives sont responsables de la transmis- sion du virus d'un organisme à un autre. Ces formes occlusives sont constituées de virions enveloppés dans une matrice protéique cristalline essentiellement consti¬ tuée d'une seule protéine : la polyédrine.

Il a été démontré que le gène de la polyédrine possédait un promoteur exceptionnellement fort qui per¬ mettait d'assurer un niveau d'expression élevé du gène placé sous son contrôle. MILLER signale donc qu'il serait particulièrement avantageux d'utiliser les baculovirus

comme vecteurs d'expression, en insérant sous contrôle du promoteur de la polyédrine l'ADN exogène que l'on désire exprimer.

D'autres travaux [SMITH et SUMMERS., J.Virol. 45, 215-225 (1983)] ont montré que le virus AcNPV possé¬ dait un autre promoteur tardif fort, qui est le promoteur du polypeptide lOkDa, ou protéine P10.

En outre la capside des baculovirus peut contenir de grandes quantités d'ADN et ne constitue donc pas une limite au nombre ou à la longueur des gènes insé¬ rés. En conséquence, de très nombreux vecteurs d'expression dérivés des baculovirus ont été proposés. Par exemple, la Demande de Brevet Européen 127 839, (Invention SUMMERS) , décrit un procédé permettant la production d'un vecteur d'expression recombinant, issu de baculovirus, en passant par l'intermédiaire d'un vecteur de transfert renfermant un fragment d'ADN viral qui contient le promoteur du gène de la polyédrine, en aval duquel est inséré le gène étranger. Ce vecteur de transfert est ensuite recombiné avec l'ADN du baculovirus sauvage et les recombinants possédant le gène étranger sous contrôle du promoteur de la polyédrine sont sélectionnés.

La Demande de Brevet Européen 340 359 (Inventeurs PAGE et RODGERS) décrit des vecteurs de transfert dérivés des baculovirus, dans lesquels le codon d'initiation ATG de la polyédrine est supprimé, de façon à ce que la séquence codant pour la polyédrine ne puisse pas être traduite, et qui portent un site de restriction convenant à l'insertion d'un gène exogène en aval de l'extrémité N-terminale du gène de la polyédrine, et à proximité immédiate de ladite extrémité.

L'équipe des Inventeurs a précédemment mis au point un procédé de production d'un baculovirus modifié, utilisable comme vecteur d'expression, dans lequel on insère directement et sans recourir à un vecteur de

transfert, un site de restriction approprié, en aval d'un promoteur tardif fort. Le vecteur ainsi obtenu peut être chargé, à l'emplacement du site de restriction introduit, avec le gène que l'on désire faire exprimer ; ce procédé fait l'objet de la Demande de Brevet Européen 345 152.

Dans tous les procédés connus, le gène à exprimer est inséré sous le contrôle de l'un des deux promoteurs tardifs forts présents dans le génome du bacu¬ lovirus sauvage, tandis que l'autre promoteur continue à fonctionner normalement.

Certaines constructions dérivées de baculovirus par inactivation d'un promoteur tardif fort sont connues dans l'art antérieur ; RANKIN et al. [GENE, 70, 39-49 (1988)] décrivent différentes mutations du promoteur de la polyédrine ayant pour effet d'inhiber à des degrés variés, l'expression d'un gène placé sous contrôle dudit promoteur. IATROU et al. [GENE, 75, 59-71 (1989)] décrivent l'obtention de baculovirus dans lequel le promoteur de la polyédrine a été inactivé par délétion. Ils proposent l'utilisation de ces baculovirus comme vecteurs de transfert, pour l'obtention de constructions dans lesquelles on souhaite placer un gène exogène sous le contrôle de son propre promoteur, et non sous celui du promoteur de la polyédrine. Des constructions dans lesquelles le promoteur de la protéine P10 est inactif ont également été réalisées ; QUIN et al. [J. Gen. Virol. 70, 1273-1280 (1989)] décrivent ainsi des plasmides recombinants comprenant des constructions dans lesquelles un gène exogène est placé sous le contrôle de différents mutants du promoteur de la P10. Certaines de ces mutations ont pour effet 1'inactivation totale du promoteur.

Toutefois, ces constructions n'ont été réalisées que sur des plasmides recombinants. En effet, le promoteur du gène de la P10 recouvre une partie de la séquence codant pour la protéine P26, et il est

généralement considéré qu'une mutation dans ce promoteur ne permet pas d'obtenir de baculovirus viables.

D'autre part, il a été-proposé, pour augmenter l'expression de gènes dans des vecteurs d'expression dérivés de baculovirus, de multiplier, dans un même vecteur, le nombre de copies du gène et le nombre de promoteurs. Par exemple, la Demande de Brevet Européen 0 127 839 suggère d'insérer dans un même baculovirus des copies d'un gène sous contrôle du promoteur de la polyédrine, d'autres copies sous contrôle du promoteur de la P10, et éventuellement, encore d'autres copies à d'autres emplacements du génome, chaque copie dudit gène étant sous contrôle d'un promoteur de baculovirus, ou bien de son propre promoteur. Or, les Inventeurs ont découvert, de manière inattendue, que la suppression ou 1'inactivation de l'un des deux promoteurs tardifs forts du baculovirus sauvage avait pour conséquence d'augmenter l'expression du gène placé sous le contrôle du promoteur restant. La présente invention a pour but de pourvoir à de nouveaux vecteurs d'expression, construits à partir de baculovirus modifiés, et dans lesquels un seul des deux promoteurs tardifs présents dans le baculovirus sauvage est actif. La présente invention a pour objet des vecteurs d'expression, caractérisés en ce qu'il sont obtenus à partir d'un baculovirus modifié dans lequel un des deux promoteurs tardifs forts présents dans le génome du baculovirus sauvage est inactif, et en ce que la séquence placée sous le contrôle du promoteur tardif fort actif dans ledit baculovirus modifié est différente de la séquence correspondante du baculovirus sauvage.

Au sens de la présente Invention, "séquence différente de la séquence correspondante du baculovirus sauvage" signifie en particulier que la séquence qui, chez le baculovirus sauvage, est contrôlée par le

promoteur considéré, a fait l'objet de modifications visant à permettre l'expression d'un gène exogène sous contrôle dudit promoteur. De telles modifications comprennent par exemple l'insertion d'une séquence exogène (gène que l'on désire faire exprimer, séquence portant un ou plusieurs sites de restriction, etc ... ) dans ladite séquence du baculovirus sauvage, ou à la place de tout ou partie de celle-ci.

Selon un mode de réalisation préféré d'un vecteur d'expression conforme à l'Invention, le promoteur inactif est celui du gène de la polyédrine et le promoteur actif est celui du gène de la protéine PIO.

Selon un autre mode de réalisation préféré d'un vecteur d'expression conforme à l'Invention, le promoteur inactif est celui du gène de la protéine PIO, et le promoteur actif est celui du gène de la polyédrine.

L'Invention a également pour objet des baculovirus modifiés utilisables pour l'obtention de vecteurs d'expression tels que définis plus haut. Dans ce cadre, l'Invention englobe les baculovirus modifiés, infectieux, et dans lesquels le promoteur du gène de la protéine PIO est inactif.

Chez les baculovirus AcNPV (Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus), et G NPV (Galleria mellonella Nuclear Polyhedrosis Virus), le gène du polypeptide PIO, qui est situé dans le fragment de restriction EcoRI P, est encadré en 5', par un gène codant pour un polypeptide dénommé P26, et dans la région 3 ' , par un gène codant pour un polypeptide dénommé P74. Le promoteur du gène de P10 se trouve à l'extrémité 3' du gène de P26, dans la région codante de ce dernier.

Les Inventeurs ont procédé à la délétion de la région comprise entre un site Xhol (position +569 du gène P26) et un site EaiH (position +152 du gène P10), puis ont religué ces sites, après réparation par l'enzyme de Klenow. La région correspondant au promoteur et à

l'extrémité 5' de PIO est ainsi délétée. Un gène chimérique constitué des 569 premières bases de P26 et des 130 dernières bases de PIO est obtenu ; ce gène est fonctionnel, et les baculovirus modifiés de la sorte sont parfaitement viables et produisent plus de polyédrine que le virus sauvage.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, le génome dudit baculovirus modifié est dépourvu d'une séquence d'ADN comprise entre le site X ol situé à +569pb du codon d'initiation ATG de la séquence codant pour le polypeptide P26 et le site BσlII, situé à +152pb du codon d'initiation ATG de la séquence codant pour le polypeptide PIO.

L'Invention englobe également les baculovirus suivants, dans lesquels le promoteur du gène de la polyédrine est inactif :

- un baculovirus modifié dont le génome est dépourvu d'une séquence d'ADN comprise entre le site EcpRV situé à -95 pb et le site SSDI situé à +910 pb du codon d'initiation ATG de la séquence de la polyédrine.

- un baculovirus modifié dont le génome est dépourvu d'une séquence d'ADN comprise entre le site EcoRV situé à -95 pb et le site Kpnl situé à +633 pb du codon d'initiation ATG de la séquence de la polyédrine. - un baculovirus modifié dont le génome est dépourvu d'une séquence d'ADN comprise entre le site EcoRV situé à -95 pb et le site Eco47III situé à +733 pb du codon d'initiation ATG de la séquence codant pour la polyédrine. Les Inventeurs ont constaté que les baculo¬ virus ainsi modifiés se multiplient bien en culture cel¬ lulaire, et ne produisent plus la protéine dont le promoteur est inactivé, mais en revanche, synthétisent en plus grande quantité que le baculovirus sauvage, celle dont le promoteur est actif.

Selon un autre mode de réalisation préféré de

la présente invention, les baculovirus modifiés contiennent une séquence marqueur, placée sous le contrôle du promoteur actif.

Au sens de la présente Invention, on entend par "séquence marqueur'' une séquence dont l'expression confère au baculovirus modifié un phénotype aisément identifiable. L'insertion ultérieure d'une séquence exogène à 1'intérieur de ladite séquence entraîne l'annulation dudit phénotype, ce qui permet la sélection des baculovirus ayant intégré ladite séquence exogène.

Selon une disposition particulièrement avanta¬ geuse de ce mode de réalisation, la séquence marqueur est constituée par la séquence codant pour la polyédrine, laquelle séquence est placée sous le contrôle du promo- teur du gène de la protéine PIO. Les baculovirus modifiés obtenus de la sorte recouvrent leur capacité à produire des inclusions. Une souche de baculovirus obtenue conformément à cette disposition a été déposée, en date du 17 Juillet 1990, auprès de la Collection Nationale de Microorganismes, tenue par l'Institut Pasteur à Paris. Cette souche porte le numéro de dépôt 1-978.

Selon une autre disposition particulièrement avantageuse de ce mode de réalisation, le baculovirus modifié contient la séquence codant pour la β-galactosidase, placée sous le contrôle du promoteur actif (protéine PIO ou polyédrine) . Les baculovirus modi¬ fiés de la sorte ont la propriété de former des plages virales bleues en présence du substrat X-gal.

L'utilisation de baculovirus obtenus conformément à l'une des deux dispositions qui précèdent permet, lors de l'insertion ultérieure d'un gène étranger, de sélectionner aisément les virus recombinants ayant intégré ledit gène étranger à 1'intérieur du gène de la polyédrine ou de celui de la β-galactosidase. En effet, dans le premier cas, lesdits virus recombinants ne forment plus de polyèdres ; dans le deuxième cas, ils

forment des plages blanches, au lieu des plages bleues.

Pour obtenir des baculovirus modifiés utilisables pour l'obtention des vecteurs d'expression conformes à l'Invention, l'on procède à l'inactivation, par tous moyens appropriés, de 1'un des promoteurs tardifs forts présents dans le génome du baculovirus sauvage.

L'on procède par exemple de la sorte à 1'inactivation du promoteur de la polyédrine, ou du promoteur de la protéine PIO par excision d'un fragment d'ADN comprenant ledit promoteur.

L'excision dudit fragment d'ADN peut être effectuée à l'aide d'enzymes de restriction.

Il va de soi que d'autres procédés, comme par exemple, des procédés classiques faisant appel à des techniques de recombinaison homologue, peuvent être utilisés pour procéder à l'excision du fragment d'ADN désiré.

L'inactivation de l'un ou l'autre des deux promoteurs peut également être effectuée par mutagénèse de séquences participant à l'activité dudit promoteur, par exemple comme décrit dans la publication de RAKIN et al. précitée.

Des vecteurs d'expression chargés conformes à l'Invention, peuvent être obtenus à partir des baculovirus modifiés, par divers procédés connus en eux- mêmes, par exemple, et de façon non limitative, en utilisant des vecteurs de transfert, tels que ceux décrits dans les Demandes de Brevet Européen 127 839 et 340 359, ou bien par insertion directe, comme décrit dans la Demande de Brevet Européen 345 152) .

La séquence codant pour la protéine exogène que 1'on désire faire exprimer est insérée sous contrôle du promoteur actif ; la séquence qui, chez le baculovirus sauvage est normalement placée sous contrôle dudit promoteur, peut être totalement ou partiellement excisée,

et remplacée par la séquence codant pour la protéine exogène.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de construction des baculovirus modifiés et des vecteurs d'expression conformes à l'invention. Il va toutefois de soi que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de la présente invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Construction d'un baculovirus modifié dé¬ pourvu du promoteur et du gène de structure de la poly¬ édrine

Les protocoles utilisées dans cet exemple et les suivants font appel à des techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par MANIATIS et al. [Molecular cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982] . Les conditions particulières à chaque expérimentation sont, s'il y a lieu, précisées dans l'exemple correspondant.

Des baculovirus modifiés conformes à l'Invention sont obtenus par digestion partielle de l'ADN du baculovirus sauvage par deux enzymes de restriction, dont les sites de coupure se situent pour l'une d'entre elles, en amont du promoteur de la polyédrine, et pour l'autre, en aval dudit promoteur, soit dans la séquence codant pour la polyédrine, soit en aval de ladite séquence.

L'ADN génomique total d'un baculovirus appartenant à la souche Autographa calxfornica est coupé successivement par les enzymes EcoRV et Eco47Ill suivant la technique de digestion partielle décrite dans "Current Protocols in Molecular Biology" ; Ausubel et al. Eds. ; publié par Geene Publishing Associates and Wiley Interscience (paragraphe 3.1.6.).

Les conditions choisies sont les suivantes :

Coupure par EcoRV

10 μg d'ADN de Baculovirus sont dilués dans 100 μl de tampon Tris HC1 10 mM (pH 7,5), 10 mM MgC12, 150 mM NaCl 3 unités d'enzyme par μg d'ADN sont ajoutées.

Des dilutions successives sont réalisées dans le même tampon, et pour chaque dilution, après une incubation de 15 minutes à 37 ^*C, les produits de restriction sont analysés sur gel d'agarose afin de déterminer la dilution qui ne donne qu'une coupure par molécule d'ADN viral.

La dilution retenue est, pour Eco RV, de 1/27. Coupure par Eco 47 III

Les conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites pour Eco RV. La dilution retenue est de 1/54.

Les molécules coupées par EcoRV et Eco47III sont pourvues d'extrémités franches, ce qui permet de procéder directement à leur ligation pour obtenir des molécules d'ADN viral circulaire.. Les molécules d'ADN viral résultantes sont utilisées, après purification, pour transfecter des cultures de cellules de Spodoptera frugiperda (Souche SF9, ATCC n^* CRL 1711), selon le protocole décrit par GRAHAM et VAN DER ERB, [Virology, 52, 305 - 309 (1973)]. Dans ces conditions, les molécules d'ADN por¬ tant la délétion souhaitée sont infectieuses, et donnent des virus qui produisent des plages ne formant pas de polyèdres.

Ces virus sont appelés virus pob^". EXEMPLE 2

L'ADN génomique du baculovirus Autographa Californica est digéré successivement par les enzymes Kr.nl et £l££RV, dans les conditions décrites à l'exemple I, à ceci près que le traitement par Kon I est effectué dans un tampon sans NaCl, et à une dilution de 1/9. Les molécules sont ensuite religuées et utilisées

pour transfecter des cultures de Spodoptera Frugiperda, comme décrit précédemment. EXEMPLE 3

On procède comme décrit dans les exemples 1 ou 2, à ceci près que le baculovirus sauvage utilisé appar¬ tient à la souche Galleria mellonella .

EXEMPLE 4 Insertion de la séquence codant pour la β-galactosidase sous contrôle du promoteur de la protéine PIO Le fragment de restriction Eco Rl-P, obtenu à partir du génome du baculovirus Autographa Californica sauvage, et qui contient le gène de structure de la protéine PIO, est inséré dans le lieur multisite du plasmide pUC9 au site Ego RI. Ce fragment contient un site unique EglII, situé à +152 pb par rapport au codon ATG du gène PIO. Un fragment BamHl comprenant la majeure partie du gène de la β-galactosidase, (qui possède un site fîâH_l en aval de son propre ATG) est inséré au site BσlII ; les cadres de lecture du début de la protéine PIO et de la β-galactosidase sont ainsi en phase.

Le plasmide obtenu (D3PZ) possède donc le début du gène de la protéine PIO, et le gène de la β-galactosidase. On cotransfecte des cellules de Spodoptera frugiperda avec le plasmide D3PZ et l'ADN du virus pob^" (1 μg de D3PZ ; 0,5 μg d'ADN de pob- ; le protocole est identique à celui de l'exemple 1) et on sélectionne les baculovirus recombinants (pob~ β-galactosidase) , qui forment des plages bleues en présence de X gai. Les virus recombinants obtenus expriment la β-galactosidase en quantité très importante, comme le montre l'exemple 7 ci-dessous.

EXEMPLE 5 : Introduction du gène de structure de la polyédrine à la place du gène de structure de la protéine PIO

Le fragment Eco Rl-I de l'ADN génomique du baculovirus d 'Autographa californica, contenant le gène de la polyédrine a été clone dans le lieur multisite du plasmide pUC18 au site EcoRI. Un site PvuII a été introduit, à -2 bases par rapport au codon ATG de la séquence codant pour la polyédrine. D'autre part, un plasmide de contenant le fragment Eco Rl-P du génome du baculovirus d 'Autographa californica (cf. exemple 4) est ouvert au site BσlII.

Après action de l'enzyme Bal31. puis de la polymérase de

Klénow un linker BalII est introduit. On obtient ainsi un plasmide appelé pGH 80-82, dépourvu de la majeure partie de la séquence codant pour la protéine PIO, et portant un site ÊglII en position -4 par rapport à l'ATG de la protéine PIO.

Le gène de structure de la polyédrine, excisé du plasmide pUC18 à l'aide des enzymes de restriction £5û_II et £££47111, est introduit au site BσlII du plas¬ mide pGH 80-82, après restauration des extrémités franches par la polymérase de Klénow.

Le plasmide obtenu, appelé pGH 80-82 ob⁺ est utilisé, avec le virus pob^" obtenu à l'Exemple 1, pour cotransfecter des cellules de Spodoptera frugiperda .

Les virus recombinants (pob^~ ob⁺) , qui forment des polyèdres, sont sélectionnés.

Une souche de virus recombinants (pob^~ob⁺) a été déposée le 17 Juillet 1990, auprès de la Collection Nationale de Microorganismes, sous le numéro 1-978. EXEMPLE 6 : Clonage du gène de l'Acétylcholinestérase (Ache) de Drosophile

Un fragment d'ADNc obtenu à partir de l'ARNm de l'Ache a été clone au préalable dans un plasmide pEMBLδ entre les sites Sma I et Eco RI. A partir dudit

plasmide, le gène de l'Ache est excisé par l'action des enzymes FSPI (site à -14 pb du codon ATG de l'Ache) et Sacl (site à + 117 pb du codon de terminaison de l'Ache) . Après traitement par l'ADN polymérase du phage T , le fragment obtenu est inséré dans le plasmide pGH 80-22, au site Bσl II, dont les extrémités ont été au préalable rendues franches par la polymérase de Klénow. Le plasmide obtenu est appelé pGH 80-22 Ache. Ce plasmide est utilisé - ou bien pour cotransfecter des cellules avec l'ADN d'un virus pob^" ob⁺ ; on sélectionne alors les recombinants qui ne forment plus de polyèdres

- ou bien pour cotransfecter des cellules avec l'ADN d'un virus pob^" β-galactosidase : dans ce cas, les virus recombinants sélectionnés seront ceux qui forment des plages blanches.

EXEMPLE 7 : Expression du gène de la β-galactosidase : Comparaison entre des baculovirus recombinants connus dans l'art antérieur et les vecteurs d'expression conformes à l'Invention.

Trois constructions ont été réalisées :

- le gène de la β-galactosidase est "fusionné" à celui de la polyédrine (Polyédrine-β-Gal. ) . Le virus recombinant est de type classique (il possède les deux promoteurs forts) ;

- le gène de la β-galactosidase est fusionné à celui du polypeptide P10 (AcplOZ) . Le virus recombinant, est de type classique (il possède les deux promoteurs forts et fabrique des polyèdres) ; - le gène de la β-galactosidase a été fusionné à celui du polypeptide PIO (D3PZ) . Le virus recombinant, de type pob^", ne possède plus le promoteur ni le gène de la polyédrine. Ces différents virus recombinants ont été utilisés pour transfecter des cellules de Spodoptera frugiperda .

Aux temps suivants : 24h, 48h, 72h après infection

l'activité β-galactosidase est mesurée dans le surnageant de culture et 'dans les cellules elles-mêmes en utilisant l'ONPG comme substrat chromogène. 3 mesures sont faites sur chaque point.

Les résultats sont résumés dans le Tableau I suivant :

TABLEAU I.

(Unité β-Gal = 1000 (DO 20)/temps (min) x volume (ml) Cel = Cellules Sn = Surnageant

48 heures après transfection, le surnageant de culture renferme très peu d'activité (il n'y a pas encore de lyse cellulaire). Les cellules D3PZ renferment 1,4 fois plus d'activité que les cellules Polyédrine β-Gal. A 72 heures malgré une lyse cellulaire qui devient importante, D3PZ possède toujours plus d'activité que les autres constructions.

EXEMPLE 8 - Construction d'un baculovirus modifié dé¬ pourvu du promoteur et du gène de structure de la protéine P10

L'ADN génomique total d'un baculovirus appartenant à la souche Autographa californica est coupé successivement par les enzymes Xhol et BσlII, suivant la technique de digestion partielle indiquée à 1'exemple 1. Les conditions mises en oeuvre sont les suivantes :

Coupure par Xhol

10 μg d'ADN de Baculovirus sont dilués dans 100 μl de tampon Tris HC1 50 mM (pH 7,5), 10 M MgCl₂, 100 mM NaCl. 3 unités d'enzyme par μg d'ADN sont ajoutées.

Des dilutions successives sont réalisées dans le même tampon, et pour chaque dilution, après une incubation de 15 minutes à 37 'C, les produits de restriction sont analysés sur gel d'agarose afin de déterminer la dilution qui ne donne qu'une coupure par molécule d'ADN viral.

La dilution retenue est, pour Xhol, de 1/27. coupure par eqlii

10 μg d'ADN de Baculovirus sont dilués dans 100 μl de tampon Tris HC1 10 mM (pH 7,5), 10 mM MgCl, 50 mM NaCl.

Les autres conditions expérimentales sont les mêmes que celles décrites pour Xhol.

La dilution retenue est de 1/54. Les extrémités des molécules coupées par Xhol et ÊSLII sont réparées par l'enzyme de Klénow avant de procéder à leur ligation.

Les molécules d'ADN viral résultantes sont utilisées pour transfecter des cultures de cellules de Spodoptera frugiperda. Dans ces conditions, les molécules d'ADN por¬ tant la délétion souhaitée sont infectieuses.

Ces virus sont appelés virus PIO^" ; ils produisent plus de polyédrine que le virus sauvage* EXEMPLE 9 - Insertion du gène de la β-galactosidase dans un baculovirus modifié conforme à l'Invention

Un vecteur de transfert obtenu à partir d'un plasmide pUC8, et comprenant le fragment EcoRl-I du baculovirus (Cf. Exemple 5), qui contient un site unique

Bam HI, à +171 bases du codon ATG du gène de la polyédrine, est utilisé pour cette construction.

Un fragment Bam HI du gène de la

β-galactosidase (Cf. Exemple 4) est inséré au site Bam HI dudit vecteur de transfert.

Les vecteurs ainsi obtenus sont utilisés, en même temps que des baculovirus modifiés P10^~, obtenus par le protocole décrit dans l'exemple 8, pour cotransfecter les cellules de Spodoptera frugiperda .

Les baculovirus ayant intégré le gène de la β-galactosidase ne forment plus de polyèdres, mais synthétisent la β-galactosidase, facilement détectable et quantifiable par coloration spécifique avec le substrat chromogène X-gal.

La production de β-galactosidase par les baculovirus modifiés ainsi obtenus a été comparée, comme décrit à l'exemple 7, avec celle d'une construction similaire obtenue à partir de baculovirus "sauvages"

(possédant le promoteur de la protéine PIO et celui de la polyédrine) . Le taux de β-galactosidase produit 48 heures après infection, est de 25% plus élevé chez les baculovirus modifiés dépourvus du promoteur de la protéine PIO que chez les baculovirus sauvages.

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Feuille facultative relative au micro-organisme mentionné en page 7 . ligne 1 7 —2 1 tj» la description i

A. IDENTIFICATION DU DEPOT *

D'autre* dépôt* aont Identifié* aur une feuille aupplémentaire > P]

Nom de l'institution de dépôt *

COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES DE L'INSTITUT PASTEUR

Adreaae de l'institution de dépôt (y compris le code postal et le pays) *

28, Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15 (FRANCE)

Date du dépôt . ^ _JUILLET H _{9 9 Q} N' d'ordre » T -978

INDICATIONS SUPPLÉMENTAIRES ' (à ne remplir que *i nécessaire). Une fouilla eeperée est iolπt* pour la suite de ces renseignements Q

En ce qui concerne les désignations dans lesquelles un brevet européen est demandé, un échantillon du micro-organisme dépo¬ sé ne sera accessible, jusqu'à la publication de la mention de la délivrance du brevet européen ou jusqu'à la date à laquelle la demande sera rejetée, retirée ou réputée retirée, que par la remise d'un échantillon à un expert désigné par le requérant (règle 28.4 de la CBE) .

ETATS DÉSIGNÉS POUR LESQUELS LES INDICATIONS SONT DONNÉES • (si les Indications ne sont paa données pour tous les Stats désignés)

BREVET EUROPEEN - AUSTRALIE - BULGARIE - CANADA - FINLANDE - HONGRIE - JAPON - NORVEGE - POLOGNE - UNION SOVIETIQUE - ETATS-UNIS D'AMERIQUE - TCHECOSLOVAQUIE.

D. INDICATIONS FOURNIES SÉPARÉMENT • (à ns remplir que si nécessaire)

Les indications énumérées ci-après seront soumises ultérieurement au Bureau International * (spécifier la nature générale dea indi¬ cations p. ex., « No d'ordre du dépit»)

E. Q La présenta feuille a été reçu* avec la demande internattonaia lorsque celle-ci a été dépoaée (i vérifier par l'office récepteur)

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